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【干货集锦】|| 通过凝胶电泳打开生物分析的大门
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01
原理
某物质在电场作用下的迁移速率叫做电泳的速率,电泳的速率与核酸大小和构型有关的,因分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场作用下向正极涌动,分子质量越小跑得越快,紧密构型快于松散型开环分子或线性分子,从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同,在自由涌动时核酸分子的迁移率相对区别很小,难以分开,但采用适当浓度的凝胶戒指作为电泳支持物,发挥分子筛的功能,使得分子大小和构象不同的核酸分子涌动率产生较大的差别,则可达到分离的目的。
一般有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳A、 琼脂糖是一种线性多糖聚合物,可以形成具有刚性的滤孔凝胶,孔隙的大小取决定于琼脂糖的浓度,浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。多用于核酸分离。B、 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法,聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好有弹性透明光学性质稳定,对PH和温度变化小,没有吸附和电渗作用小的特点,是一种很好的电泳支持介质。多用于蛋白质分离。
02
实验方法
A、 琼脂糖凝胶电泳的实验方法是,首先制备琼脂糖凝胶,二、制备凝胶板三、加样,四、电泳,五、染色,六、结果观察。B、 聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验步骤包括,首先安装电泳槽,二、制备凝胶,三、样品处理与加样,四、电泳,五、离胶与固定,六、染色与脱色。
03
结果与分析
相对迁移率的计算:相对迁移率Mr=蛋白质样品距加样端距离迁移距离/酚蓝区带中心距加样端距离。绘制标准曲线:以每条marker在的相对迁移率为横坐标,相应分子量的对数值为纵坐标,绘制标准曲线。未知蛋白质样品分子量的测算:计算未知蛋白质样品的相对迁移率,在标准曲线上找到对应的纵坐标,即可得到该样品的分子量。
结果初步分析:数量分析:条带的宽度,荧光的亮度质量分析:纯度和分子量影响因素:DNA分子的大小:实验证明,DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比;琼脂糖的浓度:一定大小的DNA片段,在不同浓度的琼脂糖凝胶电泳中电泳迁移速率不同DNA分子的构型:不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速率差别较大。
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